抗體選擇和稀釋

對(duì)于任何一種給定的目標(biāo)抗原，都有不止一種有效抗體。為了縮小選擇范圍，實(shí)驗(yàn)中通常要考慮以下幾個(gè)方面：

1、分析或者應(yīng)用類型

2、樣品的性質(zhì)

3、樣品的種類

4、抗體宿主的中落淚

5、抗體的標(biāo)記和檢測(cè)

樣品的性質(zhì)：根據(jù)樣品的性質(zhì)選擇合適的抗體至少要考慮以下幾個(gè)方面

1、要檢測(cè)的蛋白區(qū)域。刺激宿主動(dòng)物產(chǎn)生抗體的抗原物質(zhì)種類繁多，包括全長(zhǎng)的蛋白、蛋白片段、多肽、整個(gè)生物機(jī)體（例如細(xì)菌）或細(xì)胞。免疫原通常在說(shuō)明書中會(huì)有顯示（但有一些情況抗原是資料，不能公開）。如果要檢測(cè)的是一個(gè)蛋白片段或全長(zhǎng)蛋白的異構(gòu)體或特定區(qū)域，應(yīng)該選擇由該特異片段或區(qū)域或者包含該特異片段或區(qū)域所制備的抗體。如果要通過(guò)FACS去檢測(cè)活細(xì)胞表面蛋白，則要選擇由胞外區(qū)蛋白抗原制備的抗體。

2、樣品的處理工藝。有些抗體要求樣品先進(jìn)行特殊處理。例如，許多抗體只識(shí)別降解或變性蛋白，可能因?yàn)檫@樣可 暴露藏在二次或三次折疊后蛋白內(nèi)部的抗原表位。另一方面，有些抗體卻只能識(shí)別自然折疊狀態(tài)蛋白上的表位。（Abcam公司用于western blotting的抗體，樣品都需進(jìn)行降解和變性處理，除非在說(shuō)明書中特別標(biāo)明）。當(dāng)搜尋用于免疫組化的抗體時(shí)，則應(yīng)注意有些抗體只適合用于未固定冷凍組織。有時(shí)，抗原修復(fù)步驟則*，這樣可以消除由福爾馬林固定所引起的交聯(lián)，因?yàn)橛行┛贵w不能結(jié)合福爾馬林固定和石蠟包埋組織中的目標(biāo)抗原。上述限制會(huì)在說(shuō)明書的應(yīng)用章節(jié)中明確標(biāo)出。

樣品的種類

盡管由于具有足夠多的同源氨基酸序列，抗體有可能和其它物種的同一靶蛋白反應(yīng)，但是我們選擇抗體時(shí)仍然應(yīng)該選擇來(lái)源于同一物種的抗原。如果樣品不是來(lái)自于列表所示的物種之一，不能說(shuō)明該抗體不可以用來(lái)檢測(cè)這種樣品，但是來(lái)自該物種的樣品未被檢測(cè)過(guò)，因此我們很難推薦它的適用性。根據(jù)序列相似性可以預(yù)測(cè)交叉反應(yīng)性，值得驕傲的是Abcam在說(shuō)明書里有ExPASy和NCBI  BLAST的鏈接，可以比對(duì)不同物種來(lái)源氨基酸序列的同源性。

選擇一抗宿主的類別

一般來(lái)說(shuō)，當(dāng)用標(biāo)記二抗來(lái)檢測(cè)非標(biāo)記一抗時(shí)，產(chǎn)生一抗的宿主動(dòng)物的類別就非常重要。對(duì)于免疫組化，產(chǎn)生一抗的宿主應(yīng)盡可能和樣品的宿主種類不同，以避免二抗的免疫球蛋白與樣品中內(nèi)在的免疫球蛋白發(fā)生潛在的交叉反應(yīng)。例如，用于檢測(cè)鼠源蛋白的一抗就不應(yīng)來(lái)源于小鼠或大鼠，選用來(lái)源于兔的一抗和抗兔的標(biāo)記lgG二抗進(jìn)行檢測(cè)，會(huì)比較合適。如一抗已直接附有標(biāo)記，則可避免上述交叉反應(yīng)發(fā)生。對(duì)于不含內(nèi)源性免疫球蛋白樣品的檢測(cè)，宿主的種類選擇不用很嚴(yán)格。例如進(jìn)行western blotting的細(xì)胞裂解液就被認(rèn)為不包含lgG會(huì)以50和25kDa的條帶出現(xiàn)在在降解和變性樣品中，分別相當(dāng)于lgG分子的重鏈和輕鏈。

選擇二抗

二抗應(yīng)來(lái)源于一抗的物種。舉例來(lái)說(shuō)，如果您的一抗來(lái)源于鼠，那么二抗也就應(yīng)該選擇抗鼠的。我們建議仔細(xì)核對(duì)二抗說(shuō)明書以確定您要使用的二抗經(jīng)過(guò)測(cè)試可用于您的實(shí)驗(yàn)。Abcam提供有大量標(biāo)記各種熒光物質(zhì)和染色物質(zhì)的二抗。檢查您所用的一抗數(shù)據(jù)表的底部，將會(huì)顯示一些合適的二抗。

雙重染色體的選擇

對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞或組織進(jìn)行雙免疫染色要求非標(biāo)記一抗來(lái)源于不同物種的動(dòng)物，而二抗則特異性識(shí)別其中一種一抗。二抗如果與其它動(dòng)物來(lái)源的免疫球蛋白有交叉吸附，則會(huì)再說(shuō)明書中明確說(shuō)明。

熒光和染料標(biāo)簽：標(biāo)簽抗體的目的是要看到抗體結(jié)合的信息。標(biāo)簽的選擇依據(jù)以下幾個(gè)方面

1、檢測(cè)方法：英冠或有色沉淀。英冠標(biāo)簽會(huì)再特定波長(zhǎng)的光激發(fā)下發(fā)光。有多重?zé)晒饪晒┻x用，不同熒光標(biāo)簽有*的吸收和激發(fā)波長(zhǎng)。在結(jié)合了合適的底物時(shí)，酶標(biāo)簽HRP和AP可以形成有色沉淀。

2、封固劑（只限免疫組化）：AEC、Fast Red、INT或是其它的水溶性染色劑均溶于酒精，因此要求使用水溶性封固劑。一上提到的其它有機(jī)物要想得到較好的折射率，使用有機(jī)封固劑封固。熒光素標(biāo)簽需要水溶性封固劑。膽藻素蛋白（藻青蛋白/藻紅蛋白）需要不加甘油的水溶性封固劑，否則會(huì)產(chǎn)生淬滅效應(yīng)。

3、生物素標(biāo)記的抗體對(duì)于信號(hào)的放大是很有效的，比如可應(yīng)用于親和素-生物素-酶或熒光復(fù)合物（通常縮寫為ABC試劑）或者親和素或鏈霉親和素結(jié)合酶或熒光染料檢測(cè)法。

未純化抗體的稀釋和濃縮

未純化抗體中的目標(biāo)抗體濃度有很大的差異。如果不清楚未純化抗體樣品的濃度，就可以參考下面的“特殊范圍”作為估計(jì)的指導(dǎo)。